روش تکنیکی پاتولوژي
پاتولوژي
روش هاي تکنيکي و دستگاه‌هاي مورد استفاده در بخشپاتولوژي
پاتولوژيدر اصل به معناي آسيب شناسي است و به مطالعه و شناسايي اختلالات عملي و تغييرات ساختاري بافت ها مي‌پردازد .بهطور کليآسيب شناسي عبارت از مطالعه بيماري‌هاست و به عنوان شاخه اي از علم پزشکي بهبررسي علل پيدايش بيماري‌ها و عوارض ناشي از آنها مي‌پردازد. بديهي است در هنگامبروز يک بيماري، تغييراتي در بافت‌هاي مختلف بدن ايجاد مي‌شود که در واقع مطالعههمين تغييرات مبنا و اساس پاتولوژي را تشکيل مي‌دهد. لذا پاتولوژي علمي است که راجعبه تغييرات مختلف بدن در هنگام بيماري بحث و گفتگو مي‌نمايد. به چگونگي اينتغييرات پاتوژنزيز (pathogenesis) مي‌گويند که به دو گروه تشريحي و بالينيتقسيم مي‌شود.
پاتولوژي 4 جنبه مهم از يک بيماري رابررسي مي‌کند که عبارت است از:
1)اتيولوژي (علت شناسي)،
2)پاتوژنز(مکانيسم ايجاد)،
3)مرفولوژي (ريخت شناسي)
4)اهميت باليني
رشته‌هاي پاتولوژي
1)پاتولوژيتشريحي(Anatomical) : عبارت است از مطالعه تغييرات ساختماني اعم از ميکروسکوپي وماکروسکوپي و ضايعات وارده به سلول هاي بدن که شامل:
الف) اتوپسي (نمونهبرداري از بافت مرده) ،
ب) بيوپسي (نمونه برداري از بافت زنده
ج)سيتوپاتولوژي (سلول شناسي).
2) پاتولوژي باليني( (clinical که علايم بيماريرا در خون، ادرار، مايع نخاعي، خلط، ترشحات واژن در بخش هاي مختلف ميکروب شناسي،بيوشيمي،سرم شناسي و... بررسي مي‌نمايد.
روش تکنيکي آسيب شناسي (هيستوتکنيک (
تمام مراحل کاري از ابتداي پذيرش نمونه درآزمايشگاه پاتولوژي تا آماده سازيلام و بررسي آن در زير ميکروسکوپ به عنوان روش هاي تکنيکي آسيب شناسي در نظر گرفتهمي‌شود که شامل هفت مرحله جداگانه است:
1) فيکساسيون،
2) نمونه برداري ياپاس دادن،
4) آبگيري و آغشتگي،
4) قالب‌گيري،
5) برش با ميکروتوم،
6) رنگ‌آميزي و
7) مونتاژ لام و لامل .
بديهي است دقت در هر يک از اينمراحل همراه با سرعت در کار لازمه تهيه يک برش ميکروسکوپي مناسب و لام خوب برايتشخيص دقيق است به طوري که اشکال درهر يک از روش هاي مختلف به کار گرفته شدهمي‌تواند سبب کاهش دقت تشخيص بيماري و به دنبال آن ايجاد اشکال در روند درمان بيمار شود.
در ادامه توضيح مختصري درباره هريک از اين مراحل پرداخته مي‌شود:
1)فيکساسيون(fixation)
اين مرحله صرفا"جهت حفظ ساختمان فيزيکي بافت و براي جلوگيري ازاتوليز (Autolysis) آن انجام مي‌شود. نمونه جراحي شده بايد بلافاصله درون مادهفيکساتيو قرار بگيرد. براي اين کار بايد نوع بافت، درجه حرارت دوران پروسه، زمانفيکساسيون و PH محلول هاي به‌کار برده شده را در نظر داشت. براي مثال مايعپايدارکننده يا فيکساتيو، بايد سلول زنده را هر چه سريعتر کشته و به سرعت در بافتنفوذ نمايد و در صورت امکان ساختمان طبيعي سلول و بافت را تغيير ندهد و همچنين بعضي از مواد نيمه مايع و کلوئيدي را با عمل فيکساسيون تبديل به مواد نيمه جامد(gel) کند. در مجموع ماده فيکساتيو را بايد طوري انتخاب کرد که در بافت وهمچنين در رنگ‌آميزي آن خللي ايجاد نکند. براي انجام اين کار فيکساتيوهاي مختلفيوجود دارد ولي فرمالين 10% معمول ترين فيکساتيو به کار گرفته شده است. زمان ماندننمونه در فرمالين (فرم آلدئيد) بستگي به حجم و نوع نمونه دارد به‌طوري‌که هر 4 ساعت 7/2 ميلي متر فرمالين داخل بافت نفوذ مي‌کند ولي معمولا" نمونه‌ها را 24 ساعت درفرمالين قرار مي‌دهند. البته لازم به ذکر است نمونه‌هايي مانند استخوان، دندان و بهطور کلي بافت هايي که داراي رسوبات آهکي باشد بايدپيش از فيکساسيون، دکلسيفيه شودتا بتوان آن را براي مراحل بعدي آماده کرد.
1)دکلسيفيکاسيون به معني آزادکردنمواد معدني (کلسيم) از بافت استخواني و شامل مراحل زير است:
الف) تهيه نسوج ،ب) فيکساسيون، ج) دکلسيفيکاسيون، د) خنثي کردن و ه) شستشو با آب.
محلولدکلسيفيکاسيون بايد داراي خصوصيات زير باشد:
الف)کلسيم را به طور کلي از بافتآزاد کند،
ب) به بافت اصلي آسيبي وارد نکند و
ج)در رنگ‌آميزي اختلال ايجادنکند.
2)نمونه برداري يا پاس دادن:
براي اجراي اين مرحله، نمونه بايد از لحاظاندازه کاملا" مناسب باشد. چنانچه نمونه بزرگتر از حد معمول باشد مواد آبگير مانندگزيلول، الکل و ... نمي‌تواند در آن نفوذ کند و چنانچه خيلي کوچک باشد تهيه نمونه وبه دنبال آن برش و تهيه لام و... مشکل خواهد شد. براي هر کدام از نمونه‌ها بايدمشخصات بافت را بهطور کامل گزارش کرد. اين مشخصات شامل: حالت، ابعاد، ضخامت، رنگ،ترشحات و... است. همين‌طور براي جداکردن نمونه‌ها از يکديگر و شناسايي آنها بايدشماره نمونه همراه با سال نمونهبرداري را به‌وسيله مداد روي کاغذ نوشته و همراه بابافت داخل ظروف مخصوص گذاشته و نمونه را براي مراحل بعدي آماده کرد.در شکل (1) ميزپاس همراه با وسايل مربوطه مشاهده مي‌شود.
3)آبگيري و آغشتگي:
اين کار توسط دستگاهي به نام تيشو پروسسور (Tissue Processor) انجام مي‌شود که شامل دوازده ظرف حاوي محلول هاي مختلف است. اين محلول‌ها 3 وظيفه بر عهده دارد:
الف) آبگيري، ب) شفاف کردن و ج) آغشتگي باپارافين
حجم کلي هر ظرف 1000ميلي ليتر است و ترتيب آنها بدين صورت است:
ظروفشماره 1و2 حاوي فرمالين 10% است. نمونه برش داده شده حدود 3 ساعت در فرمالين قرارمي‌گيرد. (چنانچه اين زمان بيشتر باشد اشکالي ايجاد نمي‌کند ). در بعضي موارد، درظرف شماره 2 به جاي فرمالين از آب مقطر استفاده مي‌شود. مدت زمان قرار گرفتن نمونهدر آب مقطر يک ساعت است.
ظرف‌هاي سوم تا ششم شامل الکل (متانول) است، ظرفشماره 3 الکل 70%و ظرف شماره 4 الکل 80%، ظرف شماره 5 الکل 90% و ظرف شماره 6 الکل 96% است. علت صعودي انتخاب کردن اين الکل‌ها اين است که آبگيري به آرامي انجامشود. زمان قرار گرفتن نمونه در هر کدام از اين الکل‌ها يک ساعت است. به طور کلياتانول بهتر از متانول آبگيري مي‌کند ولي به علت هزينه بالاتر، از متانول استفادهمي‌شود. در عين حال متانول خاصيت رنگبري هم دارد. اين مرحله بسيار مهم است و چنانچهآبگيري با الکل به خوبي انجام نشود مراحل بعدي نيز دچار اشکال شده وسبب چروکيدگيبافت‌ها خواهد گرديد.
ظروف شماره‌هاي 7و8 حاوي الکل متانول مطلق 100% استکه درمجموع 4ساعت آبگيري آنها به طول مي‌انجامد. ظروف 9 و10 گزيلول است که وظيفهشفاف‌سازي بافت و خارج کردن الکل از آن را به عهده دارد.
ظروف شماره 11و12 حاويپارافين است. پارافين در دماي آزمايشگاه جامد است و بايد به دماي ذوب ( 60 درجهسانتي گراد)، برسد براي همين منظور دو ظرف آخر داراي المنتي است که باعث توليدحرارت در ظرف و ذوب شدن پارافين مي‌شود. بعد از اينکه نمونه داخل پارافين مذابقرار گرفت. اين ماده داخل بافت نفوذ کرده و بافت به حالت آغشتگي مي‌رسد. پارافين درشکاف و درز بافت نفوذ مي‌کند و در دماي آزمايشگاه بافت سفت و سخت شده و قابل برش باميکروتوم خواهد شد. لازم به ذکر است که ماده آغشتگي با ماده قالب‌گيري بايد يکيباشد.
دستگاه تيشو پروسسور مجهز به دکمه‌هاي خودكار تنظيم زمان (Timer)،دکمه‌هاي روشن و خاموش و بالا و پائين و چرخشي و چراغ‌هايي براي اطمينان از روشنبودن دستگاه و همچينين دکمه‌هاي تنظيم برنامه و تعيين سيکل دستگاه است تا معمولا" حدود 18 ساعت طول مي‌کشد که يک سيکل کامل شود. در شکل شماره (2) دستگاه تيشوپروسسورمشاهده مي‌شود.
4) قالب‌گيري :
براي قالب‌گيري بايد ماده آغشتگي (پارافين) را در دماي 60 درجهسانتي گراد داخل فور ذوب کرده و مقداري موم به نسبت 1 به 10 به آن اضافه کرد. ازموم براي قالب‌گيري محکم استفاده مي‌شود. در صورتيکه فقط از پارافين استفاده شودقالب‌ها بسيار شکننده خواهند شد. پس از اين مرحله کار روي نمونه‌ها وارد مسير جديديمي‌شود که شامل قالب‌گيري، برش و رنگ‌آميزي و در نهايت مونتاژ لام و لامل است. برايقالب‌گيري بايد نمونه‌هاي آبگيري شده را به وسيله پنست داخل ظرف مخصوص قالب‌گيريقرار داده، روي آن محلول موم و پارافين ريخت و بعد از گذشت چند دقيقه شمارهنمونه‌ها را روي آنها قرار داد. اين عمل در اصطلاح کوله کردن نمونه‌ها ناميدهمي‌شود و نياز به دقت کافي دارد. براي کامل‌تر شدن اين مرحله قالب‌ها تا شروع زمانبرش داخل يخچال قرار مي‌گيرد.
5) برش با ميکروتوم :
براي شروع اين مرحله به چند دستگاه جداگانه نياز است که ايندستگاه‌ها و وسايل شامل: ميکروتوم، تيشوفلوت، چراغ مطالعه و قلم الماس است.
1) ميکروتوم: دستگاهي است که از آن براي تهيه برش هاي نازک از بافتي که به صورت بلوکدر آمده، استفاده مي‌کنند. اين دستگاه داراي توانايي برش بافت در ضخامت‌هاي گوناگوناست و آن را به دو بخش بيروني و دروني تقسيم مي‌کنند. در بخش دروني دستگاه، چرخدنده‌هاي مختلفي تعبيه شده است که به وسيله دسته ميکروتوم به چرخش در مي‌آيد و ميلهتنظيم ميکرومتر، درجه تنظيمي را به داخل منتقل مي‌کند. با چرخش دسته مي‌توان برشهايي به ضخامت 1 تا 30 ميکرون و حتي بالاتر تهيه کرد. قسمت بيروني دستگاه شاملدسته، گيره بلوک، پيچ تنظيم زاويه بلوک، جاي نگهدارنده چاقوي ميکروتوم، پيچ تنظيمکننده زاويه تيغ ميکروتوم، درجه ميکرومتر و پيچ يا دسته جلوبرنده چاقو به وسيلهدست است. بر روي دسته، ميله‌اي تعبيه شده که به‌وسيله آن مي‌توان دسته را قفل نمودهتا کاملا ثابت شود و بدين‌وسيله احتمال آسيب به دست يا خراب شدن بلوک کم مي‌شود. درشکل (3) دستگاه ميکروتوم مشاهده مي‌شود.
تيشوفلوت
اين دستگاه در واقع ظرفياست که در آن آب ريخته مي‌شود و قسمتي در زير يا اطراف آن تعبيه شده که محلقرارگيري گرمکن دستگاه است و به‌وسيله کليد کنترل کننده، دماي آب به دلخواه تنظيممي‌شود که اين دما به پارافين اطراف نمونه بستگي دارد. لازم به توضيح است که داخلظرف بايد تيره باشد. بدين منظور معمولا" به وسيله تفلون يا رنگ کوره اي سياهپوشانده مي‌شود. در واقع اين دستگاه براي برطرف کردن چين وچروک بافت هاي برش خوردهاست.
3) چراغ مطالعه: اين وسيله بر روي ميکروتوم و آب و الکل و تيشوفلوت احاطهداشته و نور مناسب و کافي آن از خستگي مفرط چشم جلوگيري مي‌کند. در شکل (4) دستگاهتيشوفلوت به همراه چراغ مطالعه مشاهده مي‌شود.
قلم الماس: همانطور که ازنامش پيداست، براي نوشتن به کار مي‌رود. نوک قلم بايد از الماس باشد تا بتواندشماره نمونه‌ها را بهطور خوانا روي لام که جنس شيشه دارد حک کند.
همانطور کهگفته شد مرحله پنجم از هستيوتکنيک برش با ميکروتوم است. در اين مرحله نمونه‌هايقالب‌گيري شده را به وسيله ميکروتوم به ضخامت 5 ميکرون برش مي‌دهند. ميکروتوم موجوددر آزمايشگاه‌ها معمولا" از نوع دواري است که براي برش بهتر لازم است نمونه‌ها راحدود يک دقيقه روي يخ قرار داد؛ البته بعضي از ميکروتوم‌ها ازنوع انجمادي است. طوريکه گاز CO2 از داخل محفظه اي آزادشده و اين گاز ايجاد سرما مي‌کند و برشبافتها به طورخود به‌خود در انجماد صورت مي‌گيرد.
6) رنگ‌آميزيبافت‌ها:
اين مرحله شامل دو نوع روتين و اختصاصي است:
رنگ‌آميزي روتين: روش رنگ‌آميزي که در آزمايشگاه‌هاي پاتولوژي به طور معمول و روتين استفاده مي‌شود،روش هماتوکسيلين- ائوزين است. با اين روش هسته سلول رنگ بنفش و سيتوپلاسم رنگ صورتيبه خود مي‌گيرد.
دراين رنگ‌آميزي، ابتدا 3 حمام گزيلول موجود است که براي شفافسازي و از بين بردن پارافين باقي مانده در اطراف بافت‌ها استفاده مي‌شود. نمونه‌هادر هر ظرف گزيلول به مدت 5 دقيقه قرار داده مي‌شود. بعد از گزيلول 4 ظرف الکل درجهبندي شده قرار دارد. نمونه‌ها را در هر کدام به مدت 2-1 دقيقه گذاشته و بعد با آبشستشو داده مي‌شود و بعد بلافاصله در ظرف حاوي هماتوکسيلين قرار مي‌گيرد. زمانقرار گرفتن در هماتوکسيلين 15-10 دقيقه است كه اين زمان بستگي به تازه يا کهنه بودنرنگ دارد. لازم است بعد از اين مرحله نمونه‌ها با آب شستشو داده شده و بافت هاياضافي اطراف آنها پاک شود. بعد از تميز کردن لام‌ها، آنها را داخل اسيد الکل شناورکرده تا رنگ هاي اضافي داخل بافت از بين برود. بعد از اسيد الکل نوبت به کربناتکلسيم مي‌رسد. وظيفه اين محلول، رنگ‌آميزي زمينه بافت است و باعث مي‌شود هسته آبيبه نظر برسد. ظرف بعدي ائوزين است که باعث قرمز شدن سيتوپلاسم مي‌گردد. بعد از چندثانيه که نمونه ها داخل ائوزين قرار گرفت آنها را با آب شستشو داده، بعد به ترتيبداخل 4 ظرف الکل قرار مي‌گيرد. اين الکل‌ها هم درجه بندي شده و به ترتيب 70-80-90 و 96درجه است و بافت‌ها در هر کدام، حدود 5-3 ثانيه قرار مي‌گيرد. 2 ظرف آخر شاملگزيلول است که براي شفاف تر شدن بافت‌ها استفاده مي‌شود. زمان قرارگيري نمونه‌هادرگزيلول در حدود 5-3دقيقه است.
رنگ‌آميزي اختصاصي: در اين رنگ‌آميزي هر جزء ازسلول رنگ خاصي به خود مي‌گيرد.
رنگ‌آميزي اختصاصي شامل:
1- رنگ‌آميزي برشهاي انجمادي،
2- رنگ‌آميزي بافت همبندي،
3- رنگ‌آميزي نمونه‌هاي دستگاهعصبي،
4- رنگ‌آميزي براي برخي مواد سيتوپلاسميک،
5- رنگ‌آميزي برايآنزيم‌ها،
6- رنگ‌آميزي براي ميکروارگانيسم‌ها و
7- رنگ‌آميزيسيتولوژيک.
رنگ‌آميزي‌هاي اختصاصي داراي روش‌هاي مختلفي است که هر کدام توسطپزشک معالج درخواست و در آزمايشگاه پاتولوژي بسته به شرايط موجود انجام مي‌شود. درشکل شماره (5) ظروف رنگ‌آميزي مشاهده مي‌شود.
7) مونتاژ لام و لامل :
براي اينکارابتدا لازم است پشت لام‌ها را خشک کرده و بعد لاملي را که قبلا" روي آن يک تا دو قطره چسب مخصوص ريخته شده، با پنس روي لام قرار داد. بعد اطراف لام را کاملا" تميز کرده و اجازه داد تا در دماي آزمايشگاه خشک شود. در آخر شماره نمونه‌ها رويبرچسب نوشته شده و با دقت روي لام‌ها چسبانده مي‌شود. سپس لام‌ها همراهبابرگه در خواست آنها در اختيار پاتولوژيست براي تشخيص نهايي قرار گيرد.
بررسي پاتولوژيک بافت به روش Frozen Section
روشي است که جراح در حين عمل جراحي براي اطلاع از تشخيص سريع ودقيق نوع تومور (بد خيم يا خوش خيم بودن) و تعيين نوع عمل جراحي درخواست مي‌کند . بنابراين در اين مسير سرعت عمل نقش بسيارمهمي ايفا مي‌کند. Section Frozen درزمينه‌هاي مختلف مورد استفاده است به عنوان مثال وقتي قسمتي از روده جهت بررسي نوعتومور توسط جراح خارج مي‌شود جهت اطمينان از آناستوموز دو انتهاي آزاد روده، جراحدرخواست آزمايش Frozen مي‌دهد. لذا براي جلوگيري از عمل مجدد و صرفه جويي در وقتو هزينه و... از اين روش تشخيصي استفاده مي‌شود. به طور کلي Frozen Section بهمجموعه عملياتي گفته مي‌شود که روند آمادگي بافت جهت تشخيص پاتولوژيک را کوتاه وزمان تشخيص را براي آگاهي جراح سريعتر مي‌کند. به علاوه اجزاي سلولي مانند چربي‌هامي‌تواند با روش هاي رنگ‌آميزي خاص، زير ميکروسکوپ ديده شود. براي انجام اين کار ازدستگاهي به نام کرايو استيت (Cryostat) استفاده مي‌شود. در اين دستگاه ميکروتوم،بافت و چاقو همگي در يک اتاقک با کنترل دما که سطح آن با پلي‌اورتان عايق‌بندي شده،قرار دارد. اصول کار بدين صورت است که نمونه‌اي از بافت مورد نظر بيمار جدا شده وبلافاصله از اتاق عمل به آزمايشگاه پاتولوژي فرستاده مي‌شود. قطعه مورد نظر توسطپاتولوژيست از بافت جدا وبراي شروع عمليات آماده مي‌شود. سپس نمونه در دستگاه قرارداده شده، پس از منجمد شدن براي برش آماده مي‌گردد. ميکروتوم‌هاي Cryostatمي‌تواند جهت بريدن نمونه‌هاي بافتي با مقاطعي به ضخامت 50-1 ميکرومتر تنظيم شود. بعد از برش، نمونه براي رنگ‌آميزي آماده است. براي اين کار بايد ابتدا نمونه را باالکل 95 درجه فيکس کرد، بعد از گذشت چند ثانيه نمونه در محلول هماتوکسيلين قرارداده مي‌شود، زمان براي اين محلول 3-2دقيقه است .کربنات و ائوزين محلول‌هاي بعدياست که زمان براي هر کدام از اين محلول‌ها حدود 3-2 ثانيه است. بعد نوبت به 4 الکلدرجه‌بندي شده (70-80-90-95) مي‌رسد. نمونه در هر کدام از اين محلول‌ها حدود 1 تا 2ثانيه شناور مي‌شود و در نهايت براي شفاف تر شدن، نمونه در دو ظرف گزيلول قراردادهشده و براي مونتاژ و تشخيص آماده مي‌شود و در انتها جواب آزمايش توسط پاتولوژيستتلفني به جراح اطلاع داده مي‌شود تا روند صحيح ادامه عمل پيگيري شود.
تفاوت روش روتين با روشFrozen Section در بررسي نمونه‌هاي بافتي به‌شرح ذيل است:
1)اختلافنماي مرفولوژيک از نظر طرح بافتي و نوع سلولي، بين نمونه فروزن و پرمننت وجود داردکه در ارگانهاي مختلف شدت اين موضوع متفاوت است،
2)به دليل افزايش اندازههسته‌ها و سلول‌ها امکان خطاي تشخيص و عدم امکان رسيدن به تشخيص نهايي در روشFrozen بيشتر است و
3)در اين روش ممکن است نوع سلول کاملا شبيه انواعديگري از سلول‌ها شده و امکان تشخيص دقيق فراهم نباشد، به عنوان مثال ممکن استماکروفاژ به شکل اپيتليال ديده شود.
روش هاي تکنيکي و دستگاه‌هاي مورد استفاده در بخشپاتولوژي
پاتولوژيدر اصل به معناي آسيب شناسي است و به مطالعه و شناسايي اختلالات عملي و تغييرات ساختاري بافت ها مي‌پردازد .بهطور کليآسيب شناسي عبارت از مطالعه بيماري‌هاست و به عنوان شاخه اي از علم پزشکي بهبررسي علل پيدايش بيماري‌ها و عوارض ناشي از آنها مي‌پردازد. بديهي است در هنگامبروز يک بيماري، تغييراتي در بافت‌هاي مختلف بدن ايجاد مي‌شود که در واقع مطالعههمين تغييرات مبنا و اساس پاتولوژي را تشکيل مي‌دهد. لذا پاتولوژي علمي است که راجعبه تغييرات مختلف بدن در هنگام بيماري بحث و گفتگو مي‌نمايد. به چگونگي اينتغييرات پاتوژنزيز (pathogenesis) مي‌گويند که به دو گروه تشريحي و بالينيتقسيم مي‌شود.
پاتولوژي 4 جنبه مهم از يک بيماري رابررسي مي‌کند که عبارت است از:
1)اتيولوژي (علت شناسي)،
2)پاتوژنز(مکانيسم ايجاد)،
3)مرفولوژي (ريخت شناسي)
4)اهميت باليني
رشته‌هاي پاتولوژي
1)پاتولوژيتشريحي(Anatomical) : عبارت است از مطالعه تغييرات ساختماني اعم از ميکروسکوپي وماکروسکوپي و ضايعات وارده به سلول هاي بدن که شامل:
الف) اتوپسي (نمونهبرداري از بافت مرده) ،
ب) بيوپسي (نمونه برداري از بافت زنده
ج)سيتوپاتولوژي (سلول شناسي).
2) پاتولوژي باليني( (clinical که علايم بيماريرا در خون، ادرار، مايع نخاعي، خلط، ترشحات واژن در بخش هاي مختلف ميکروب شناسي،بيوشيمي،سرم شناسي و... بررسي مي‌نمايد.
روش تکنيکي آسيب شناسي (هيستوتکنيک (
تمام مراحل کاري از ابتداي پذيرش نمونه درآزمايشگاه پاتولوژي تا آماده سازيلام و بررسي آن در زير ميکروسکوپ به عنوان روش هاي تکنيکي آسيب شناسي در نظر گرفتهمي‌شود که شامل هفت مرحله جداگانه است:
1) فيکساسيون،
2) نمونه برداري ياپاس دادن،
4) آبگيري و آغشتگي،
4) قالب‌گيري،
5) برش با ميکروتوم،
6) رنگ‌آميزي و
7) مونتاژ لام و لامل .
بديهي است دقت در هر يک از اينمراحل همراه با سرعت در کار لازمه تهيه يک برش ميکروسکوپي مناسب و لام خوب برايتشخيص دقيق است به طوري که اشکال درهر يک از روش هاي مختلف به کار گرفته شدهمي‌تواند سبب کاهش دقت تشخيص بيماري و به دنبال آن ايجاد اشکال در روند درمان بيمار شود.
در ادامه توضيح مختصري درباره هريک از اين مراحل پرداخته مي‌شود:
1)فيکساسيون(fixation)
اين مرحله صرفا"جهت حفظ ساختمان فيزيکي بافت و براي جلوگيري ازاتوليز (Autolysis) آن انجام مي‌شود. نمونه جراحي شده بايد بلافاصله درون مادهفيکساتيو قرار بگيرد. براي اين کار بايد نوع بافت، درجه حرارت دوران پروسه، زمانفيکساسيون و PH محلول هاي به‌کار برده شده را در نظر داشت. براي مثال مايعپايدارکننده يا فيکساتيو، بايد سلول زنده را هر چه سريعتر کشته و به سرعت در بافتنفوذ نمايد و در صورت امکان ساختمان طبيعي سلول و بافت را تغيير ندهد و همچنين بعضي از مواد نيمه مايع و کلوئيدي را با عمل فيکساسيون تبديل به مواد نيمه جامد(gel) کند. در مجموع ماده فيکساتيو را بايد طوري انتخاب کرد که در بافت وهمچنين در رنگ‌آميزي آن خللي ايجاد نکند. براي انجام اين کار فيکساتيوهاي مختلفيوجود دارد ولي فرمالين 10% معمول ترين فيکساتيو به کار گرفته شده است. زمان ماندننمونه در فرمالين (فرم آلدئيد) بستگي به حجم و نوع نمونه دارد به‌طوري‌که هر 4 ساعت 7/2 ميلي متر فرمالين داخل بافت نفوذ مي‌کند ولي معمولا" نمونه‌ها را 24 ساعت درفرمالين قرار مي‌دهند. البته لازم به ذکر است نمونه‌هايي مانند استخوان، دندان و بهطور کلي بافت هايي که داراي رسوبات آهکي باشد بايدپيش از فيکساسيون، دکلسيفيه شودتا بتوان آن را براي مراحل بعدي آماده کرد.
1)دکلسيفيکاسيون به معني آزادکردنمواد معدني (کلسيم) از بافت استخواني و شامل مراحل زير است:
الف) تهيه نسوج ،ب) فيکساسيون، ج) دکلسيفيکاسيون، د) خنثي کردن و ه) شستشو با آب.
محلولدکلسيفيکاسيون بايد داراي خصوصيات زير باشد:
الف)کلسيم را به طور کلي از بافتآزاد کند،
ب) به بافت اصلي آسيبي وارد نکند و
ج)در رنگ‌آميزي اختلال ايجادنکند.
2)نمونه برداري يا پاس دادن:
براي اجراي اين مرحله، نمونه بايد از لحاظاندازه کاملا" مناسب باشد. چنانچه نمونه بزرگتر از حد معمول باشد مواد آبگير مانندگزيلول، الکل و ... نمي‌تواند در آن نفوذ کند و چنانچه خيلي کوچک باشد تهيه نمونه وبه دنبال آن برش و تهيه لام و... مشکل خواهد شد. براي هر کدام از نمونه‌ها بايدمشخصات بافت را بهطور کامل گزارش کرد. اين مشخصات شامل: حالت، ابعاد، ضخامت، رنگ،ترشحات و... است. همين‌طور براي جداکردن نمونه‌ها از يکديگر و شناسايي آنها بايدشماره نمونه همراه با سال نمونهبرداري را به‌وسيله مداد روي کاغذ نوشته و همراه بابافت داخل ظروف مخصوص گذاشته و نمونه را براي مراحل بعدي آماده کرد.در شکل (1) ميزپاس همراه با وسايل مربوطه مشاهده مي‌شود.
3)آبگيري و آغشتگي:
اين کار توسط دستگاهي به نام تيشو پروسسور (Tissue Processor) انجام مي‌شود که شامل دوازده ظرف حاوي محلول هاي مختلف است. اين محلول‌ها 3 وظيفه بر عهده دارد:
الف) آبگيري، ب) شفاف کردن و ج) آغشتگي باپارافين
حجم کلي هر ظرف 1000ميلي ليتر است و ترتيب آنها بدين صورت است:
ظروفشماره 1و2 حاوي فرمالين 10% است. نمونه برش داده شده حدود 3 ساعت در فرمالين قرارمي‌گيرد. (چنانچه اين زمان بيشتر باشد اشکالي ايجاد نمي‌کند ). در بعضي موارد، درظرف شماره 2 به جاي فرمالين از آب مقطر استفاده مي‌شود. مدت زمان قرار گرفتن نمونهدر آب مقطر يک ساعت است.
ظرف‌هاي سوم تا ششم شامل الکل (متانول) است، ظرفشماره 3 الکل 70%و ظرف شماره 4 الکل 80%، ظرف شماره 5 الکل 90% و ظرف شماره 6 الکل 96% است. علت صعودي انتخاب کردن اين الکل‌ها اين است که آبگيري به آرامي انجامشود. زمان قرار گرفتن نمونه در هر کدام از اين الکل‌ها يک ساعت است. به طور کلياتانول بهتر از متانول آبگيري مي‌کند ولي به علت هزينه بالاتر، از متانول استفادهمي‌شود. در عين حال متانول خاصيت رنگبري هم دارد. اين مرحله بسيار مهم است و چنانچهآبگيري با الکل به خوبي انجام نشود مراحل بعدي نيز دچار اشکال شده وسبب چروکيدگيبافت‌ها خواهد گرديد.
ظروف شماره‌هاي 7و8 حاوي الکل متانول مطلق 100% استکه درمجموع 4ساعت آبگيري آنها به طول مي‌انجامد. ظروف 9 و10 گزيلول است که وظيفهشفاف‌سازي بافت و خارج کردن الکل از آن را به عهده دارد.
ظروف شماره 11و12 حاويپارافين است. پارافين در دماي آزمايشگاه جامد است و بايد به دماي ذوب ( 60 درجهسانتي گراد)، برسد براي همين منظور دو ظرف آخر داراي المنتي است که باعث توليدحرارت در ظرف و ذوب شدن پارافين مي‌شود. بعد از اينکه نمونه داخل پارافين مذابقرار گرفت. اين ماده داخل بافت نفوذ کرده و بافت به حالت آغشتگي مي‌رسد. پارافين درشکاف و درز بافت نفوذ مي‌کند و در دماي آزمايشگاه بافت سفت و سخت شده و قابل برش باميکروتوم خواهد شد. لازم به ذکر است که ماده آغشتگي با ماده قالب‌گيري بايد يکيباشد.
دستگاه تيشو پروسسور مجهز به دکمه‌هاي خودكار تنظيم زمان (Timer)،دکمه‌هاي روشن و خاموش و بالا و پائين و چرخشي و چراغ‌هايي براي اطمينان از روشنبودن دستگاه و همچينين دکمه‌هاي تنظيم برنامه و تعيين سيکل دستگاه است تا معمولا" حدود 18 ساعت طول مي‌کشد که يک سيکل کامل شود. در شکل شماره (2) دستگاه تيشوپروسسورمشاهده مي‌شود.
4) قالب‌گيري :
براي قالب‌گيري بايد ماده آغشتگي (پارافين) را در دماي 60 درجهسانتي گراد داخل فور ذوب کرده و مقداري موم به نسبت 1 به 10 به آن اضافه کرد. ازموم براي قالب‌گيري محکم استفاده مي‌شود. در صورتيکه فقط از پارافين استفاده شودقالب‌ها بسيار شکننده خواهند شد. پس از اين مرحله کار روي نمونه‌ها وارد مسير جديديمي‌شود که شامل قالب‌گيري، برش و رنگ‌آميزي و در نهايت مونتاژ لام و لامل است. برايقالب‌گيري بايد نمونه‌هاي آبگيري شده را به وسيله پنست داخل ظرف مخصوص قالب‌گيريقرار داده، روي آن محلول موم و پارافين ريخت و بعد از گذشت چند دقيقه شمارهنمونه‌ها را روي آنها قرار داد. اين عمل در اصطلاح کوله کردن نمونه‌ها ناميدهمي‌شود و نياز به دقت کافي دارد. براي کامل‌تر شدن اين مرحله قالب‌ها تا شروع زمانبرش داخل يخچال قرار مي‌گيرد.
5) برش با ميکروتوم :
براي شروع اين مرحله به چند دستگاه جداگانه نياز است که ايندستگاه‌ها و وسايل شامل: ميکروتوم، تيشوفلوت، چراغ مطالعه و قلم الماس است.
1) ميکروتوم: دستگاهي است که از آن براي تهيه برش هاي نازک از بافتي که به صورت بلوکدر آمده، استفاده مي‌کنند. اين دستگاه داراي توانايي برش بافت در ضخامت‌هاي گوناگوناست و آن را به دو بخش بيروني و دروني تقسيم مي‌کنند. در بخش دروني دستگاه، چرخدنده‌هاي مختلفي تعبيه شده است که به وسيله دسته ميکروتوم به چرخش در مي‌آيد و ميلهتنظيم ميکرومتر، درجه تنظيمي را به داخل منتقل مي‌کند. با چرخش دسته مي‌توان برشهايي به ضخامت 1 تا 30 ميکرون و حتي بالاتر تهيه کرد. قسمت بيروني دستگاه شاملدسته، گيره بلوک، پيچ تنظيم زاويه بلوک، جاي نگهدارنده چاقوي ميکروتوم، پيچ تنظيمکننده زاويه تيغ ميکروتوم، درجه ميکرومتر و پيچ يا دسته جلوبرنده چاقو به وسيلهدست است. بر روي دسته، ميله‌اي تعبيه شده که به‌وسيله آن مي‌توان دسته را قفل نمودهتا کاملا ثابت شود و بدين‌وسيله احتمال آسيب به دست يا خراب شدن بلوک کم مي‌شود. درشکل (3) دستگاه ميکروتوم مشاهده مي‌شود.
تيشوفلوت
اين دستگاه در واقع ظرفياست که در آن آب ريخته مي‌شود و قسمتي در زير يا اطراف آن تعبيه شده که محلقرارگيري گرمکن دستگاه است و به‌وسيله کليد کنترل کننده، دماي آب به دلخواه تنظيممي‌شود که اين دما به پارافين اطراف نمونه بستگي دارد. لازم به توضيح است که داخلظرف بايد تيره باشد. بدين منظور معمولا" به وسيله تفلون يا رنگ کوره اي سياهپوشانده مي‌شود. در واقع اين دستگاه براي برطرف کردن چين وچروک بافت هاي برش خوردهاست.
3) چراغ مطالعه: اين وسيله بر روي ميکروتوم و آب و الکل و تيشوفلوت احاطهداشته و نور مناسب و کافي آن از خستگي مفرط چشم جلوگيري مي‌کند. در شکل (4) دستگاهتيشوفلوت به همراه چراغ مطالعه مشاهده مي‌شود.
قلم الماس: همانطور که ازنامش پيداست، براي نوشتن به کار مي‌رود. نوک قلم بايد از الماس باشد تا بتواندشماره نمونه‌ها را بهطور خوانا روي لام که جنس شيشه دارد حک کند.
همانطور کهگفته شد مرحله پنجم از هستيوتکنيک برش با ميکروتوم است. در اين مرحله نمونه‌هايقالب‌گيري شده را به وسيله ميکروتوم به ضخامت 5 ميکرون برش مي‌دهند. ميکروتوم موجوددر آزمايشگاه‌ها معمولا" از نوع دواري است که براي برش بهتر لازم است نمونه‌ها راحدود يک دقيقه روي يخ قرار داد؛ البته بعضي از ميکروتوم‌ها ازنوع انجمادي است. طوريکه گاز CO2 از داخل محفظه اي آزادشده و اين گاز ايجاد سرما مي‌کند و برشبافتها به طورخود به‌خود در انجماد صورت مي‌گيرد.
6) رنگ‌آميزيبافت‌ها:
اين مرحله شامل دو نوع روتين و اختصاصي است:
رنگ‌آميزي روتين: روش رنگ‌آميزي که در آزمايشگاه‌هاي پاتولوژي به طور معمول و روتين استفاده مي‌شود،روش هماتوکسيلين- ائوزين است. با اين روش هسته سلول رنگ بنفش و سيتوپلاسم رنگ صورتيبه خود مي‌گيرد.
دراين رنگ‌آميزي، ابتدا 3 حمام گزيلول موجود است که براي شفافسازي و از بين بردن پارافين باقي مانده در اطراف بافت‌ها استفاده مي‌شود. نمونه‌هادر هر ظرف گزيلول به مدت 5 دقيقه قرار داده مي‌شود. بعد از گزيلول 4 ظرف الکل درجهبندي شده قرار دارد. نمونه‌ها را در هر کدام به مدت 2-1 دقيقه گذاشته و بعد با آبشستشو داده مي‌شود و بعد بلافاصله در ظرف حاوي هماتوکسيلين قرار مي‌گيرد. زمانقرار گرفتن در هماتوکسيلين 15-10 دقيقه است كه اين زمان بستگي به تازه يا کهنه بودنرنگ دارد. لازم است بعد از اين مرحله نمونه‌ها با آب شستشو داده شده و بافت هاياضافي اطراف آنها پاک شود. بعد از تميز کردن لام‌ها، آنها را داخل اسيد الکل شناورکرده تا رنگ هاي اضافي داخل بافت از بين برود. بعد از اسيد الکل نوبت به کربناتکلسيم مي‌رسد. وظيفه اين محلول، رنگ‌آميزي زمينه بافت است و باعث مي‌شود هسته آبيبه نظر برسد. ظرف بعدي ائوزين است که باعث قرمز شدن سيتوپلاسم مي‌گردد. بعد از چندثانيه که نمونه ها داخل ائوزين قرار گرفت آنها را با آب شستشو داده، بعد به ترتيبداخل 4 ظرف الکل قرار مي‌گيرد. اين الکل‌ها هم درجه بندي شده و به ترتيب 70-80-90 و 96درجه است و بافت‌ها در هر کدام، حدود 5-3 ثانيه قرار مي‌گيرد. 2 ظرف آخر شاملگزيلول است که براي شفاف تر شدن بافت‌ها استفاده مي‌شود. زمان قرارگيري نمونه‌هادرگزيلول در حدود 5-3دقيقه است.
رنگ‌آميزي اختصاصي: در اين رنگ‌آميزي هر جزء ازسلول رنگ خاصي به خود مي‌گيرد.
رنگ‌آميزي اختصاصي شامل:
1- رنگ‌آميزي برشهاي انجمادي،
2- رنگ‌آميزي بافت همبندي،
3- رنگ‌آميزي نمونه‌هاي دستگاهعصبي،
4- رنگ‌آميزي براي برخي مواد سيتوپلاسميک،
5- رنگ‌آميزي برايآنزيم‌ها،
6- رنگ‌آميزي براي ميکروارگانيسم‌ها و
7- رنگ‌آميزيسيتولوژيک.
رنگ‌آميزي‌هاي اختصاصي داراي روش‌هاي مختلفي است که هر کدام توسطپزشک معالج درخواست و در آزمايشگاه پاتولوژي بسته به شرايط موجود انجام مي‌شود. درشکل شماره (5) ظروف رنگ‌آميزي مشاهده مي‌شود.
7) مونتاژ لام و لامل :
براي اينکارابتدا لازم است پشت لام‌ها را خشک کرده و بعد لاملي را که قبلا" روي آن يک تا دو قطره چسب مخصوص ريخته شده، با پنس روي لام قرار داد. بعد اطراف لام را کاملا" تميز کرده و اجازه داد تا در دماي آزمايشگاه خشک شود. در آخر شماره نمونه‌ها رويبرچسب نوشته شده و با دقت روي لام‌ها چسبانده مي‌شود. سپس لام‌ها همراهبابرگه در خواست آنها در اختيار پاتولوژيست براي تشخيص نهايي قرار گيرد.
بررسي پاتولوژيک بافت به روش Frozen Section
روشي است که جراح در حين عمل جراحي براي اطلاع از تشخيص سريع ودقيق نوع تومور (بد خيم يا خوش خيم بودن) و تعيين نوع عمل جراحي درخواست مي‌کند . بنابراين در اين مسير سرعت عمل نقش بسيارمهمي ايفا مي‌کند. Section Frozen درزمينه‌هاي مختلف مورد استفاده است به عنوان مثال وقتي قسمتي از روده جهت بررسي نوعتومور توسط جراح خارج مي‌شود جهت اطمينان از آناستوموز دو انتهاي آزاد روده، جراحدرخواست آزمايش Frozen مي‌دهد. لذا براي جلوگيري از عمل مجدد و صرفه جويي در وقتو هزينه و... از اين روش تشخيصي استفاده مي‌شود. به طور کلي Frozen Section بهمجموعه عملياتي گفته مي‌شود که روند آمادگي بافت جهت تشخيص پاتولوژيک را کوتاه وزمان تشخيص را براي آگاهي جراح سريعتر مي‌کند. به علاوه اجزاي سلولي مانند چربي‌هامي‌تواند با روش هاي رنگ‌آميزي خاص، زير ميکروسکوپ ديده شود. براي انجام اين کار ازدستگاهي به نام کرايو استيت (Cryostat) استفاده مي‌شود. در اين دستگاه ميکروتوم،بافت و چاقو همگي در يک اتاقک با کنترل دما که سطح آن با پلي‌اورتان عايق‌بندي شده،قرار دارد. اصول کار بدين صورت است که نمونه‌اي از بافت مورد نظر بيمار جدا شده وبلافاصله از اتاق عمل به آزمايشگاه پاتولوژي فرستاده مي‌شود. قطعه مورد نظر توسطپاتولوژيست از بافت جدا وبراي شروع عمليات آماده مي‌شود. سپس نمونه در دستگاه قرارداده شده، پس از منجمد شدن براي برش آماده مي‌گردد. ميکروتوم‌هاي Cryostatمي‌تواند جهت بريدن نمونه‌هاي بافتي با مقاطعي به ضخامت 50-1 ميکرومتر تنظيم شود. بعد از برش، نمونه براي رنگ‌آميزي آماده است. براي اين کار بايد ابتدا نمونه را باالکل 95 درجه فيکس کرد، بعد از گذشت چند ثانيه نمونه در محلول هماتوکسيلين قرارداده مي‌شود، زمان براي اين محلول 3-2دقيقه است .کربنات و ائوزين محلول‌هاي بعدياست که زمان براي هر کدام از اين محلول‌ها حدود 3-2 ثانيه است. بعد نوبت به 4 الکلدرجه‌بندي شده (70-80-90-95) مي‌رسد. نمونه در هر کدام از اين محلول‌ها حدود 1 تا 2ثانيه شناور مي‌شود و در نهايت براي شفاف تر شدن، نمونه در دو ظرف گزيلول قراردادهشده و براي مونتاژ و تشخيص آماده مي‌شود و در انتها جواب آزمايش توسط پاتولوژيستتلفني به جراح اطلاع داده مي‌شود تا روند صحيح ادامه عمل پيگيري شود.
تفاوت روش روتين با روشFrozen Section در بررسي نمونه‌هاي بافتي به‌شرح ذيل است:
1)اختلافنماي مرفولوژيک از نظر طرح بافتي و نوع سلولي، بين نمونه فروزن و پرمننت وجود داردکه در ارگانهاي مختلف شدت اين موضوع متفاوت است،
2)به دليل افزايش اندازههسته‌ها و سلول‌ها امکان خطاي تشخيص و عدم امکان رسيدن به تشخيص نهايي در روشFrozen بيشتر است و
3)در اين روش ممکن است نوع سلول کاملا شبيه انواعديگري از سلول‌ها شده و امکان تشخيص دقيق فراهم نباشد، به عنوان مثال ممکن استماکروفاژ به شکل اپيتليال ديده شود.
- مشخصات
- دانلود
نظرات خود را اینجا بنویسید
